یونیورسال TaqMan Multiplex QPCR Master Mix Biochemical Reagent

Universal TaqMan multiplex qPCR master mix

اصول طراحی پرایمر:

1. طول محصول تقویت توصیه می شود بین 80-300 جفت باز باشد.

2. طول پرایمر: 18-25 جفت باز;

3. محتوای پایه G+C در پرایمرها باید بین 40%-60% باشد.

4. تفاوت مقدار Tm بین پرایمرهای فوروارد و پرایمرهای معکوس کمتر از 2 ℃ است و مقدار Tm بین 58-62 ℃ بهترین است.

5. تصادفی بودن توزیع پایه.

6. پرایمرها بهتر است حاوی توالی های خود مکمل نباشند، در غیر این صورت یک ساختار سنجاق سر ثانویه را تشکیل می دهند.

7. بین دو پرایمر نباید بیش از 4 پایه مکمل یا همولوگ وجود داشته باشد، در غیر این صورت دایمر آغازگر تشکیل می شود، به خصوص همپوشانی مکمل در انتهای 3'.

8. پایه 3' انتهایی پرایمر G یا C پیشنهاد می شود.

9. هیچ محصول غیر اختصاصی دیگری در نتایج مقایسه NCBI یافت نشد.

معرفی Universal TaqMan multiplex qPCR master mix:

این محصول یک محلول پیش مخلوط 2 برابر برای qPCR با استفاده از روش فلورسانس کایمریک GSK Green I است.جزء اصلی، Taq DNA Polymerase، یک DNA پلیمراز فعال شده با حرارت است که با روش آنتی بادی مسدود شده است، که می تواند به طور موثر تقویت غیر اختصاصی را در شرایط دمای پایین مهار کند.در همین حال، ترکیب بافر واکنش بهینه شده برای qPCR، Taq DNA Polymerase برای واکنش qPCR با ویژگی و حساسیت بالا بسیار مناسب است.یک منحنی استاندارد خوب را می توان در یک منطقه کمی وسیع به دست آورد که برای تجزیه و تحلیل کمی ژن های هدف دقیق، قابل تکرار و قابل اعتماد است.در عین حال این محصول حاوی رنگ مرجع غیرفعال ROX است که برای استفاده در تمامی ابزارهای qPCR مناسب است و نیازی به تنظیم غلظت ROX بر روی ابزارهای مختلف نیست.رنگ آبی در پیش مخلوط اضافه می شود که اثر ردیاب افزودن نمونه ها را دارد و همزمان رقیق کننده قالب زرد نیز ارائه می شود.هنگامی که الگو با رقیق کننده قالب زرد رقیق می شود و به پیش مخلوط واکنش آبی اضافه می شود، رنگ از آبی به سبز تغییر می کند که می تواند نقش ردیاب در آماده سازی فرآیند سیستم واکنش داشته باشد و از نشت یا اضافه شدن نادرست جلوگیری کند.طیف رنگ‌های آبی و زرد با رنگ‌های qPCR همپوشانی ندارند و بر نتایج واکنش تأثیری نمی‌گذارند.

پروتکل سنجش / رویه‌های مربوط بهUniversal TaqMan multiplex qPCR master mix:

1. رقیق سازی قالب (اختیاری):

این کیت یک بافر رقیق سازی قالب زرد 40 برابر، یک رقیق سازی قالب زرد 40 برابری ارائه می دهد که می تواند برای تعیین دقیق اینکه آیا الگو با تغییر رنگ مایع به مایع واکنش qPCR اضافه شده است یا خیر، استفاده می شود.با در نظر گرفتن سیستم واکنش 20ul qPCR به عنوان مثال، با توجه به مقدار قالب رقت اضافه شده به محلول واکنش 20 ul qPCR، روش رقت مربوط به الگوی اصلی را می توان به جدول زیر ارجاع داد (به عنوان مثال الگوی اصلی رقیق شده به 100 ul ):

مثال:

قالب رقیق شده 2 ul باید به سیستم واکنش 20ul qPCR اضافه شود.

با در نظر گرفتن سیستم رقیق سازی 100 ul، زمانی که حجم اصلی قالب 20 ul است، بافر رقیق سازی قالب زرد 25 ul 40 x اضافه می شود و سپس آب بدون هسته 55 ul به حجم کل 100 ul اضافه می شود.

40x YELLOW TEMPLATE DILUTION BUFFER اکنون 10x است.2 لیتر از الگوی رقیق شده را به یک بافر رقیق سازی 20 لیتری اضافه کنید و بافر رقیق سازی قالب زرد 40 × نهایی 1 برابر است.در نتیجه، بافر رقت قالب زرد باید در سیستم qPCR نهایی 1 برابر باشد.

اطلاعات محصول Universal TaqMan multiplex qPCR master mix:

شرایط نگهداری و جابجایی با ترکیب اصلی Universal TaqMan multiplex qPCR:

حمل و نقل کیسه یخ مرطوب؛در دمای -20 درجه سانتیگراد نگهداری می شود و به مدت 12 ماه اعتبار دارد.

توجه داشته باشید:اگر قالب نیازی به رقیق شدن ندارد یا از رقیق کننده الگوی G3362-2 استفاده نمی شود، می توانید این مرحله را نادیده بگیرید.

2.روش واکنش PCR (با توجه به ابزار قابل تنظیم است):

الف: اگر ویژگی تقویت نیاز به بهبود داشته باشد، می توان از روش دو مرحله ای یا دمای بازپخت استفاده کرد.برای بهبود راندمان تقویت، می توان از یک روش سه مرحله ای یا زمان گسترش استفاده کرد.

توجه داشته باشید:

1. لطفاً در حین کار از دستکش یکبار مصرف استفاده کنید تا از آلودگی RNase جلوگیری شود.

2. محصولات رونویسی معکوس را می توان برای مدت کوتاهی در -20 درجه سانتیگراد ذخیره کرد.در صورت نیاز به نگهداری طولانی مدت، توصیه می شود آنها را پس از بسته بندی در دمای -80 درجه سانتیگراد نگهداری کنید تا از چرخه های انجماد و ذوب مکرر جلوگیری شود.

3. اگر الگو منشا یوکاریوتی دارد، توصیه می‌شود اولیگو (dT)18 Primer را انتخاب کنید و آن را با دم 3' Poly A mRNA یوکاریوتی جفت کنید تا بالاترین بازده cDNA تمام قد را به دست آورید.

4. برای رونویسی معکوس RNA پروکاریوتی باید از Random Hexamer Primer یا Gene Specific Primer استفاده شود.

5. Random Hexamer Primer کاربرد گسترده ای دارد و برای قالب های mRNA، rRNA، tRNA، RNA کوچک و lncRNA مناسب است.

6. اگر رونویسی معکوس با سنجش qPCR دنبال شود، پرایمر Oligo (dT)18 و پرایمر هگزامر تصادفی را می توان با هم مخلوط کرد تا بازده سنتز cDNA در تمام مناطق mRNA یکسان شود، که به بهبود صحت و تکرارپذیری نتایج کمی کمک می کند.

7. اگر پرایمرهای qPCR بعدی در سراسر اگزون ها طراحی شوند، مرحله حذف ژنوم را می توان حذف کرد.

مشکلات و راه حل های رایج:

اگر به اطلاعات بیشتری در مورد میکس اصلی Universal TaqMan multiplex qPCR نیاز دارید، لطفاً به صورت آنلاین به ما اطلاع دهید، متشکریم.